C'est peut être l'étape la plus complexe, la plus aléatoire et la plus variable du processus de mise en culture in vitro.
On distinguera deux cas de figure:
Nous ne parlerons pas ici de la culture in vitro à partir de méristèmes car cette technique demande un matériel (loupe binoculaire) et des compétences techniques (dissection) difficiles à mettre ne œuvre pour un particulier, mais pas impossible.
Cela va dépendre de l'espèce, de la technique de culture utilisée ultérieurement et du but recherché.
On peut utiliser des parties végétatives, tiges, feuilles, racines ou des organes reproducteurs, fleurs (ou pièces florales), des bourgeons, des apex...
La condition nécessaire mais pas suffisante pour réussir est d'avoir un explant le plus "propre" possible.
Les meilleurs résultats sont obtenus en prélevant une partie de plante la plus jeune possible n'ayant pas été en contact avec le substrat de culture. On utilisera pour cela un scalpel munie d'une lame stérile et tout en maintenant la partie de plante choisie à l'aide d'un forceps (pince), on coupera franchement.
On déposera ensuite l'explant dans un récipient au préalable nettoyé à l'aide d'un détergent et désinfecté.
Deux cas de figure.
Il s'agit de graines mures, déjà sorties de leur fruit. Elles doivent être les plus fraiches possibles.
Certaines espèces comme les Nepenthes produisent des graines qui ne sont viables que quelques semaines après l'ouverture du fruit.
D'autres par contre nécessiteront une période de repos que l'on appelle dormance avant de pouvoir germer.
Les espèces (et leur graines) qui rentrent en dormance vivent en général sous des climats aux saisons marquées par une alternance de périodes chaudes et froides, pluvieuses et sèches... Il est donc important de reproduire ces conditions pour que les graines germent.
C'est ainsi que pour les graines des climats tempérés à hiver froid et été chaud, on pourra placer les graines dans un papier essuie-tout humide, dans un sac hermétiquement fermé le tout dans le frigidaire pour une durée de quelques semaines.
Pour les graines des climats (très) chauds avec une alternance de saisons humides et sèches (Drosera tubéreux par exemple) on pourra utiliser le four pour leur faire subir une augmentation de température de quelques minutes à 40°C. Certains reproduisent même les conditions que l'on trouve dans le bush australien en faisant littéralement brûler les graines dans un papier journal pendant quelques secondes, la fumée ayant apparemment des vertues de levée de dormance.
Pour ma part, que ce soit pour les graines tempérées ou Australes, j'utilise du GA3 dosé à 500mg.L-1.
Vous trouverez plus de détails dans les articles concernant chaque famille ou espèce.
On ne parle pas ici de la couleur mais simplement du fait que les graines se trouvent encore dans leur fruit pas tout à fait mûres mais viables. Sur la photographie ci-dessous, vous pouvez voir la diversité de taille des fruits traités qui nécessitera des concentrations de produits désinfectants et des durées différentes.
Si le fruit a gardé toute son intégrité, il peut être stérilisé et disséqué sous hotte à flux laminaire ou glovebox.
Lorsque la capsule est ouverte, il faut racler les graines à l'aide d'une spatule ou du scalpel pour en prélever des petits amas que l'on dépose ensuite sur le milieu de culture.
Cas particulier des très petites graines type Orchidées
Avant toutes choses, il faut semer peu de graines!
La plupart des graines d'orchidées, mesurent à peine 1/10ème de millimètre voire moins.
Pour ne pas être tenté d'en semer trop, j'utilise des tubes Eppendorf de 2 ml.
La technique que j'utilise est résumée et schématisée ci-dessous.
Vous trouverez ci-dessous un schéma résumant toutes les étapes de la stérilisation des graines sèches.
D'autres méthodes existent, seringue, papier filtre... que je n'ai jamais pratiqué mais qui sont apparemment efficaces.
Je crois qu'il existe autant de protocoles de désinfection que de praticien!
Certains utilisent de l'eau de Javel à différentes dilution, d'autres de l'alcool éthylique...
Vous trouverez aussi beaucoup de bêtises sur internet, des temps de traitement trop long, des concentration ou des produits inadaptés...
Une chose est sûre, seule la pratique et plusieurs essais vous permettrons de trouver la bonne concentration et la bonne durée de traitement.
Pour ma part, j'utilise l'hypochlorite de calcium à 5% pour la quasi totalité de mes explants, que ce soit des morceaux de plantes, des fruits ou des graines.