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Une fois le milieu de culture préparé, vient le moment de le transvaser dans un récipient afin de le stériliser. Dans le langage courant, on appelle cette opération "le coulage"du milieu de culture.

I- Les différents types de récipients

Comme nous allons stériliser à haute température (121°C) l'ensemble récipient + milieu de culture, nous devons choisir des récipients capables de résister à ce traitement thermique.

  1. Le verre

Beaucoup de laboratoires et d'amateurs utilisent des récipients en verre.

Les avantages sont les suivants :

  • très résistants à la chaleur, aux chocs
  • réutilisables à l'infini
  • stable sur les étagères grâce à leur poids
  • recyclable.

Les inconvénients :

  • peut se briser lors de la stérilisation ou en tombant des étagères de votre chambre de culture
  • le couvercle qui, lui, n'est pas en verre doit être changé régulièrement
  • prix d'achat élevé.

Beaucoup d'amateurs utilisent des conserves en verre ou des petit pots de nourriture pour bébés. Il existe même des couvercles prévus à cet effet.

2. Le polypropylène

Le polypropylène est un polymère issu de l'industrie du pétrole. Les récipients fabriqués en polypropylène portent tous un de ces logo.

polypropylene.png polypropylene1.png polypropylene2.png

Les avantages sont les suivants :

  • résistant à la chaleur jusqu'à 110°C, à des températures plus hautes, il se déforme définitivement
  • réutilisable que ce soit le récipient ou le couvercle
  • très peu cher, 100 fois moins que le verre.

Les inconvénients :

  • se déforme à la chaleur
  • très léger et donc instable sur les étagères de votre chambre de culture
  • très difficilement recyclable
  1. Les récipients déjà stérilisés

Vous pouvez acheter des récipients déjà stérilisés. Ils sont la plupart du temps en verre ou en polystyrène transparent.

Les avantages sont les suivants:

  • Pas besoin de les stériliser
  • Ils sont souvent vendu par lot et peu cher (pour le polystyrène)

Les inconvénients:

  • A usage unique ou bien il faut les stériliser à nouveau (pas le polystyrène)
  • nécessité de posséder une hotte à flux laminaire.

II. La stérilisation

  1. Le milieu de culture

Une fois vos milieux préparés et vos récipients choisi, il va falloir dans un premier temps ajouter un agent solidifiant à votre préparation.

Il en existe plusieurs : gerlite, agar agar... C'est ce dernier que nous allons utiliser vu son prix raisonnable.

La quantité utilisée varie de 4,7 à 5,5 grammes. Attention, une trop forte quantité d'agar peut gêner voire annuler la disponibilité des nutriments présents dans le milieu de culture.

Agar Agar

Dans un premier temps, on va verser le milieu de culture préparé dans une casserole exclusivement réservée à cet effet.

On commence par chauffer, puis on verse petit à petit l'agar agar. A partir de ce moment et jusqu'à ébullition, il faut remuer sans arrêt au risque de voir l'agar agar s'agglomérer au fond de la casserole.

Une fois l'ébullition atteinte, on laisse encore quelques secondes puis on coule le milieu dans les récipients.

Pour ce faire, j'utilise une carafe en polypropylène avec couvercle ce qui me garanti un maintien de la température tout au long de l'opération..

  1. La stérilisation

Les récipients contenant le milieu de culture sont généralement stérilisées à l'autoclave (pour nous, une cocotte minute ou mieux, un autocuiseur) à 121 °C et  à une pression de 15 à 20 psi.

J'ai récemment fait l'acquisition (début 2016) d'un autocuiseur de grande capacité muni d'un manomètre. Il me facilite grandement la vie car sa capacité me permet de stériliser en une fois de 1 à trois litres de milieu de culture. Les photographies ci-dessous illustrent ses caractéristiques et son fonctionnement.

Si vous n'avez pas de voyant de pression ou de température, attendre que la cocotte siffle et déposer une goutte d'eau sur le couvercle. Celle ci doit commencer à bouillir quasi instantanément et s'évaporer (voir vidéo).

Si vous possédez un autocuiseur disposant d'un baromètre, attendre que la pression soit à 15 psi pour déclencher le chronomètre.

Le temps nécessaire à la stérilisation dépend du volume de milieu de culture dans le récipient (voir tableau ci-dessous).

Temps de stérilisation

Attention à ne pas dépasser ces valeurs. Certains produits que l'on utilise sont thermolabiles et une exposition prolongée à haute température diminue voire annule leur(s) effet(s).

Certains composés ne doivent pas être passés à l'autoclave (GA3, AIA,...). Ils sont rajoutés au milieu de culture autoclavé par filtration à l'aide d'une seringue munie d'un filtre de 0,22 µm. Il faut attendre que le milieu ai atteint une température d'environ 40°C pour réaliser cette opération, bien mélanger le milieu et le répartir dans les récipients.

Une fois la durée de stérilisation atteinte, attendre que la cocotte minute soit tiède pour sortir les récipients.

Entreposez les à température ambiante et attendre une bonne semaine avant de les utiliser.

Stérilisation des pots

Glossaire

Agar agar

C'est un polymère de galactose contenu dans la paroi cellulaire de certaines espèces d'algues rouges (rhodophycées).

agar.png

Il est inodore et se présente sous la forme d'un poudre orangée.

C'est le gélifiant naturel connu le plus puissant, son action est perceptible à partir de 0,1 %.

Pour obtenir ces propriétés gélifiantes, il faut le chauffer à une température supérieure à 90°C.

Le milieu commence à se figer vers les 40°C.

psi

La pression correspond à la force par unité de surface qu'exerce un fluide ou un solide sur celle-ci. Son unité dans le système international d'unités (SI) est le pascal (Pa), lequel correspond à une force de un newton par mètre carré.

1 Pa correspond à 1N/m2

Le psi est une unité anglo-saxonne de pression qui correspond au pound (livre) par square inch (pouce au carré).

1 psi = 6894,76 Pa

Lorsque nous stérilisons nos milieux de culture, la pression à l'intérieur de la cocotte est de 15 PSI.

Sur Terre, la pression atmosphérique moyenne est de:

1 013,25 hPa soit 1,013 25·105 Pa

thermolabile

La thermolabilité est la propriété d'une substance à être détruite, décomposée ou à changer de propriétés lorsqu'elle subit une élévation de température.


Date de création : 21/09/2016 11:03
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