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Culture in vitro
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C'est peut être l'étape la plus complexe, la plus aléatoire  et la plus variable du processus de mise en culture in vitro.

On distinguera deux cas de figure:

I. L'explant est une partie de plante: Clonage

Nous ne parlerons pas ici de la culture in vitro à partir de méristèmes car cette technique demande un matériel (loupe binoculaire) et des compétences techniques (dissection) difficiles à mettre ne œuvre pour un particulier, mais pas impossible.

Quelle partie de la plante?

Cela va dépendre de l'espèce, de la technique de culture utilisée ultérieurement et du but recherché.

On peut utiliser des parties végétatives, tiges, feuilles, racines ou des organes reproducteurs, fleurs (ou pièces florales), des bourgeons, des apex...

Prélèvement de l'explant

La condition nécessaire mais pas suffisante pour réussir est d'avoir un explant le plus "propre" possible.

Les meilleurs résultats sont obtenus en prélevant une partie de plante la plus jeune possible n'ayant pas été en contact avec le substrat de culture. On utilisera pour cela un scalpel munie d'une lame stérile et tout en maintenant la partie de plante choisie à l'aide d'un forceps (pince), on coupera franchement.

On déposera ensuite l'explant dans un récipient au préalable nettoyé à l'aide d'un détergent et désinfecté.

II. L'explant est une graine

Deux cas de figure.

  1. Graines sèches

Il s'agit de graines mures, déjà sorties de leur fruit. Elles doivent être les plus fraiches possibles.

Certaines espèces comme les Nepenthes produisent des graines qui ne sont viables que quelques semaines après l'ouverture du fruit.

D'autres par contre nécessiteront une période de repos que l'on appelle dormance avant de pouvoir germer.

Les espèces (et leur graines) qui rentrent en dormance vivent en général sous des climats aux saisons marquées par une alternance de périodes chaudes et froides, pluvieuses et sèches... Il est donc important de reproduire ces conditions pour que les graines germent.

C'est ainsi que pour les graines des climats tempérés à hiver froid et été chaud, on pourra placer les graines dans un papier essuie-tout humide, dans un sac hermétiquement fermé le tout dans le frigidaire pour une durée de quelques semaines.

Pour les graines des climats (très) chauds avec une alternance de saisons humides et sèches (Drosera tubéreux par exemple) on pourra utiliser le four pour leur faire subir une augmentation de température de quelques minutes à 40°C. Certains reproduisent même les conditions que l'on trouve dans le bush australien en faisant littéralement brûler les graines dans un papier journal pendant quelques secondes, la fumée ayant apparemment des vertues de levée de dormance.

Pour ma part, que ce soit pour les graines tempérées ou Australes, j'utilise du GA3  dosé à 500mg.L-1.

Vous trouverez plus de détails dans les articles concernant chaque famille ou espèce.

  1. Graines vertes

On ne parle pas ici de la couleur mais simplement du fait que les graines se trouvent encore dans leur fruit pas tout à fait mûres mais viables. Sur la photographie ci-dessous, vous pouvez voir la diversité de taille des fruits traités qui nécessitera des concentrations de produits désinfectants et des durées différentes.

Différentes capsules d’Orchidées

Fruit de Aechmea lueddemanniana (Bromeliacaea)

Si le fruit a gardé toute son intégrité, il peut être stérilisé et disséqué sous hotte à flux laminaire ou glovebox.

Lorsque la capsule est ouverte, il faut racler les graines à l'aide d'une spatule ou du scalpel pour en prélever des petits amas que l'on dépose ensuite sur le milieu de culture.

  1. Cas particulier des très petites graines type Orchidées

Avant toutes choses, il faut semer peu de graines!

La plupart des graines d'orchidées, mesurent à peine 1/10ème de millimètre voire moins.

Graine de Limodorum abortivum (Orchidacaea). Une graduation mesure 1mm

Pour ne pas être tenté d'en semer trop, j'utilise des tubes Eppendorf de 2 ml.

Quantité maximale de graines d'orchidées à stériliser

La technique que j'utilise est résumée et schématisée ci-dessous.

  1. On va tout d'abord prélever l'équivalent d'un bout de spatule de graines et le déposer dans le tube Eppendorf comme sur la photographie ci-dessus.
  2. A l'aide d'une pipette Pasteur, on prélève environ 2 ml de solution d'hypochlorite de calcium dans laquelle on aura pris soin d'ajouter une goutte de liquide vaisselle.
  3. On rempli au 3/4 le tube Eppendorf que l'on ferme soigneusement (clic).
  4. On remue pendant toute la durée du traitement qui aller de une minute (orchidées exotiques) à plus de trente minutes (Cypripedium calceolus). Les graines doivent former un mélange quasi homogène avec l'hypochlorite (éviter absolument les amas de graines qui pourraient "cacher des contaminants").
  5. Trois cas peuvent alors se produire:
  • soit les graines précipitent au fond du tube: j'utilise alors une pipette pasteur pour les 'aspirer' très délicatement (le coup de main vient assez rapidement) et les refouler sur le milieu de culture.
  • soit elles forment une "couronne" en surface autour du tube: J'utilise alors une spatule pour les récupérer et les étaler sur le milieu de culture.
  • Soit elles restent en suspension: le cas le plus difficile et le plus rare heureusement. Il faut alors attendre qu'elles précipitent (ce qui augmente d'autant la durée du traitement) ou bien utiliser une mini centrifugeuse. On en trouve au alentour de 200€ spécialement adaptées aux tubes Eppendorf. Cet achat est judicieux si vous avez à semer beaucoup de graines qui se comportent de la sorte, ce qui n'est pas mon cas.

Microentrifugeuse

Vous trouverez ci-dessous un schéma résumant toutes les étapes de la stérilisation des graines sèches.

Semis

D'autres méthodes existent, seringue, papier filtre... que je n'ai jamais pratiqué mais qui sont apparemment efficaces.

III. Quels désinfectants et quelle durée?

Je crois qu'il existe autant de protocoles de désinfection que de praticien!

Certains utilisent de l'eau de Javel à différentes dilution, d'autres de l'alcool éthylique...

Vous trouverez aussi beaucoup de bêtises sur internet, des temps de traitement trop long, des concentration ou des produits inadaptés...

Une chose est sûre, seule la pratique et plusieurs essais vous permettrons de trouver la bonne concentration et la bonne durée de traitement.

Pour ma part, j'utilise l'hypochlorite de calcium à 5% pour la quasi totalité de mes explants, que ce soit des morceaux de plantes, des fruits ou des graines.


Date de création : 21/09/2016 07:48
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