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Culture in vitro
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Longtemps réservée à une élite de professionnels (laboratoires privés, université), la culture in vitro ou micropropagation est de nos jours accessible à tous. Quelques clics sur votre ordinateur vous permettront de vous procurer le matériel ainsi que les produits chimiques nécessaires. Pour ce qui est de la méthodologie, c'est un peu plus difficile car beaucoup ne veulent pas partager leur savoir faire.

Avant de détailler les différentes étapes qui mènent de l'explant à la plante, vous trouverez ci-dessous les principales techniques utilisées.

I- Définition

"La culture in vitro ou micropropagation consiste à cultiver une partie de plante, appelée explant, dans un milieu de culture artificiel et stérile, dans des conditions de température et d'éclairage contrôlées."

Le point de départ de la mise en culture in vitro est soit une partie de la plante sélectionnée, on parle de multiplication asexuée, soit une graine, on parle alors de multiplication sexuée.

II- La multiplication asexuée : le clonage végétal

Si l'explant est une partie de la plante mère, on parle de clonage végétal ou multiplication conforme.

Les plantes ainsi obtenues auront le même capital génétique que la plante mère, ce sont des clones.

Cette technique est à rapprocher du bouturage traditionnel que l'on peut pratiquer sur plusieurs espèces comme la Vanille (ci-dessous en in vitro).

Explant de Vanille

Les avantages de cette technique sont :

  • d'obtenir, sur une très courte durée par rapport aux méthodes classiques, un nombre important de plantes identiques sélectionnées pour un caractère particulier (couleur, taille, résistance...)
  • de s'affranchir des saisons
  • de multiplier des plantes qui ne produisent pas (ou peu) de graines
  • de multiplier des plantes en voie de disparition
  • la conservation de plantes à forte valeur ajoutée sous forme de vitroplants déshydratés et cryogénisés.

Les inconvénients sont :

  • La stérilisation de l'explant
  • pas de diversité génétique
  • la possibilité de transmettre une virose cachée (hors culture méristématique) à toute une population de plantes (sylviculture)
  • le coût de production supérieur à une culture traditionnelle.

Cette technique de culture est basée sur une propriété des cellules végétales : la totipotence.

En fonction de la provenance de l'explant et de la technique utilisée, on parlera de microbouturage, d'embryogenèse somatique ou de culture de méristème.

  1. Le microbouturage
Le microbouturage est la technique la plus répandue pour produire un maximum de plantes en un minimum de temps.
Cette technique est particulièrement adaptée aux Drosera tempérés (Drosera anglica ci-dessous).

Drosera anglica

L’explant est stérilisé et placé sur un milieu nutritif lui permettant de produire un grand nombre de plantes identiques à la plante mère.
Ces plantes sont séparées de l'explant et placées sur un milieu nutritif pour donner des plantes adultes.
A partir du moment ou l'on a réussi la stérilisation de l'explant et que la plante pousse, cette opération peut être reproduite à l'infini.
Il est à noté que toutes ces étapes doivent être réalisées en condition stérile, sous hotte à flux laminaire ou glovebox.
Le schéma ci-dessous illustre les différentes étapes du microbouturage in vitro.

 microbouturage

  1. L'embryogenèse somatique

L'embryogenèse somatique consiste à produire des embryons somatiques à partir d'un explant de plante. Cette technique permet d’obtenir une multitude de clones, elle a été décrite pour la première fois chez la carotte en 1958 par Reinard et Stewart.

En fonction de l'origine de l'explant, on va parler :

  • d'embryogenèse somatique indirecte. L'explant est prélevé sur une partie quelconque de la plante. Il est mis en culture in vitro sur un milieu additionné d'hormones (auxine, cytokinine...) afin de produire un amas de cellules indifférenciées (embryons somatiques) appelé cal .

Ce cal est ensuite mis sur différents milieux hormonés afin de diriger les cellules indifférenciées vers la formation d'une nouvelle plante. (la photographie ci-dessous montre un cal de Dionée obtenu après traitement à l'auxine).

 caldionee

  • d'embryogenèse somatique directe, qui s'effectue directement à partir de cellules très jeunes. L'explant est prélevé sur une partie très jeune de la plante où sont encore présentes les cellules indifférenciées.

La photographie ci-dessous montre une section de hampe florale de Phalaenopsis cornucervi, au niveau d'un bourgeon, placée sur un milieu hormoné afin de provoquer la multiplication des cellules.

hampephalaenopsis

Cette méthode évite le passage par un cal qui peut être à l'origine de variations génétiques si cette opération est répétée plusieurs fois.

Le schéma ci-dessous illustre un exemple d'embryogenèse somatique directe sur un Nepenthes. On prélève une section de la plante située entre deux feuilles afin de stimuler le bourgeon présent. Après nettoyage et stérilisation de l'explant, il est mis sur un milieu de culture hormoné afin de stimuler le bourgeon.  La réussite de cette opération tient grandement à la qualité sanitaire de la plante mère ainsi qu'à un bon protocole de désinfection de l'explant.

 embriogenese

  1. Culture de méristème

Un méristème est une zone de la plante où les cellules prolifèrent. Il est constitué de cellules indifférenciées, capables de se diviser longtemps après la fin de l'embryogenèse.

 meristeme

On distingue sur le plan fonctionnel les méristèmes végétatifs, à l'origine de la fabrication des  tiges, des feuilles, des racines et les méristèmes reproducteurs, à l'origine des fleurs (dans le cas où la fleur ou l'inflorescence est terminale, le méristème apical passe de l'état végétatif à l'état reproducteur. Dans les autres cas, les méristèmes floraux se forment directement à l'aisselle des feuilles, à partir de bourgeons axillaires). 

Dans le cas des méristèmes végétatifs, on distingue, en se basant sur leur localisation, leur mode de fonctionnement et leur implication dans le développement du végétal, des méristèmes primaires et secondaires. Les méristèmes primaires sont situés à l'apex des racines et dans les bourgeons apicaux à l'extrémité des tiges et des rameaux (méristèmes apicaux), dans les bourgeons axillaires à l'aisselle des feuilles (méristèmes axillaires), et dans les entre-noeuds (méristèmes intercalaires). 

Le principal avantage de ce type de culture est d'obtenir des clones exempts de toute maladie. En effet, même lorsqu'une plante paraît totalement infestée par un virus ou une bactérie, les méristèmes restent indemnes.

Le principal inconvénient pour nous amateurs, est que cette technique reste réservée à des techniciens chevronnés et équipés.

 meristeme

III- La multiplication sexuée: diversité génétique

Ici, l'explant est une graine. Une attention toute particulière sera portée lors de la récolte et du stockage:

  • Ne pas récolter lors d'une journée trop humide
  • Eliminer au maximum les restes de capsule, de pistil ou tout autre impureté
  • Faire sécher dans un endroit sec et ventilé pendant plusieurs jours
  • faire un premier tri visuel (pour les graines assez grosses) et éliminer les graines atypiques
  • stocker dans un contenant hermétique au réfrigérateur en prenant soin de noter le nom de l'espèce, la date et le lieu de la récolte. Si ce sont des graines données ou achetées, noter également la provenance.

Celle-ci va être désinfectée et mise en culture sur un milieu nutritif approprié.

On obtient alors des individus génétiquement différents.

 meristeme

Glossaire

inflorescence

inflorescencegrappeepi.png

totipotence

Les cellules végétales, prélevées sur une partie quelconque d'une plante (feuille, tige, racines), possèdent la capacité de régénérer un individu complet, identique à la plante mère: c'est la dédifférenciation.

C'est cette propriété que nous allons utiliser en culture in vitro, à l'aide d'hormones végétales, pour produire en grande quantité des copies conformes à la plante mère.


Date de création : 21/09/2016 07:13
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